ELISA是一種常用的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，可以用于檢測(cè)血液、尿液、唾液、霉菌、病毒、細(xì)菌等生物樣品中的蛋白質(zhì)、抗體、肽等生物分子。
ELISA全名是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)的縮寫(xiě)，是一種利用酶標(biāo)記化的抗體或反體與待檢測(cè)物(抗原或抗體)結(jié)合，從而間接或直接檢測(cè)目標(biāo)分子的技術(shù)，屬于免疫學(xué)中的非放射性標(biāo)記方法之一。
ELISA實(shí)驗(yàn)代測(cè)步驟：
一般分為六個(gè)步驟：涂覆微孔板、酶標(biāo)記化的抗體反應(yīng)、樣品添加、次級(jí)抗體結(jié)合、添加底物、測(cè)量光密度。
1.涂覆微孔板
將捕獲抗體、配體或抗原涂覆在微孔板上，使之附著在微孔板的底部或壁上，固定在樣品檢測(cè)位置或加標(biāo)準(zhǔn)的位置。同時(shí)，涂覆后還需要加入一些特殊蛋白或物質(zhì)，例如牛血清白蛋白(BSA)等，將微孔板的其他部分進(jìn)行屏蔽，以防止非特異性結(jié)合。
2.酶標(biāo)記化的抗體反應(yīng)
將酶標(biāo)記化的初級(jí)抗體與樣品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)反應(yīng)，待時(shí)間到達(dá)絕大部分初級(jí)抗體與待檢測(cè)物或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特異性結(jié)合時(shí)，將液不沖洗干凈。
3.樣品添加
將待檢樣品加入涂覆好初級(jí)抗體的微孔板中，讓待檢樣品以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特異性結(jié)合到微孔板上涂覆好的初級(jí)抗體中。該過(guò)程也需要將板子洗液清洗干凈。
4.次級(jí)抗體結(jié)合
將酶標(biāo)記化的次級(jí)抗體加入孔內(nèi)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時(shí)間，使之與待測(cè)樣中的物質(zhì)結(jié)合。該步驟結(jié)束后，需要將板子進(jìn)行洗滌，以消除非特異性結(jié)合。
5.添加底物
將含有酶基團(tuán)的底物加入微孔板中，例如TMB、ABTS等底物，如果樣品物質(zhì)合適，底物在酶催化下會(huì)產(chǎn)生顯色反應(yīng)。直觀表示是微孔板中某些孔的液體呈現(xiàn)橘黃色，根據(jù)底物種類(lèi)的不同，孔底深度和底物的反應(yīng)時(shí)間也會(huì)有所不同。
6.測(cè)量光密度
在吸光度計(jì)或ELISA檢測(cè)儀器上對(duì)微孔板進(jìn)行讀數(shù)，根據(jù)微孔板中總體積、底物的反應(yīng)時(shí)間和吸收量來(lái)計(jì)算樣品中待檢測(cè)物質(zhì)的濃度。通常，結(jié)果是一個(gè)數(shù)字，可以根據(jù)該數(shù)字來(lái)評(píng)估待檢測(cè)物質(zhì)的存在程度或含量。
實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1.微孔板的處理
微孔板是ELISA實(shí)驗(yàn)中的重要物品，拆開(kāi)之前必須放在干凈的環(huán)境中進(jìn)行消毒，盡量避免接觸銳器或其他銳利物品，使用完后及時(shí)封閉保存，避免受到污染。
2.操作流程的嚴(yán)謹(jǐn)性
實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格的操作流程和重復(fù)性，每個(gè)流程必須按照操作規(guī)程進(jìn)行，且操作者必須熟練掌握操作技巧和注意事項(xiàng)，避免因操作不當(dāng)引起實(shí)驗(yàn)的誤差。
3.化學(xué)品的正確使用
實(shí)驗(yàn)中需要使用各種化學(xué)試劑，包括酶標(biāo)記的抗體、底物、緩沖液、洗滌液等，每個(gè)化學(xué)品都有其特殊的儲(chǔ)存、使用和處理方法，必須按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行正確使用，避免發(fā)生安全事故或影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4.數(shù)據(jù)的分析
ELISA測(cè)量數(shù)據(jù)的分析非常重要，必須進(jìn)行合理的分析和解釋?zhuān)苊庥捎跀?shù)據(jù)誤差或結(jié)果解釋不當(dāng)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)論的錯(cuò)誤。
